Tips II CosMx シングルセル空間データを生成するヒント: 検体の選択
1000プレックスでのCosMx™ SMIシングルセル空間解析を成功させるためのTipsの第2弾をお届けします。Tips 第1弾では、組織および疾患タイプ別のデータと、組織固有のサンプル調製で考慮すべきことに焦点を当てました。ここでは、組織ブロックの品質、切片の品質、不均一性、および自己蛍光の評価に焦点を当てます。
The CosMx™ SMI and decoder probes are not offered and/or delivered to the Federal Republic of Germany for use in the Federal Republic of Germany for the detection of cellular RNA, messenger RNA, microRNA, ribosomal RNA and any combinations thereof in a method used in fluorescence in situ hybridization for detecting a plurality of analytes in a sample without the consent of the President and Fellows of Harvard College (Harvard Corporation) as owner of the German part of EP 2 794 928 B1. The use for the detection of cellular RNA, messenger RNA, microRNA, ribosomal RNA and any combinations thereof is prohibited without the consent of the President and Fellows of Harvard College (Harvard Corporation).
プロトコルのアップデート
CosMx™ SMIのベストプラクティスの第2回に進む前に、ワークフローのパフォーマンスの向上を実証した2つのプロトコルの変更をお伝えしたいと思います。これらの変更は、CosMx SMIスライド作成マニュアルおよびCosMx SMI機器マニュアルに含まれており、現在NanoString University Document Libraryで入手可能です。
まず最初に、スライド前処理ワークフローでは、RNAまたはプロテインFFPEアッセイ用の抗体ミックスを調製する際に、ユーザーが添加した細胞セグメンテーションミックス1 (CD298/B2M)の量が減少します。
Table 1: 更新されたRNA染色ミックスの調製
| Cell Segmentation Mix 1 (CD298/B2m) | Marker Mix 1* (Optional PanCK/CD45) | Marker Mix 2* (optional a la Carte*) | Blocking Buffer | Total Volume |
|---|---|---|---|---|
| 4 µL x n | 8 µL x n | 8 µL x n | 180 µL x n | 200 µL x n |
Table 2: 更新されたタンパク抗体ミックスの調製
| Hs IO Protein Antibody Mix | CD298/B2M Segmentation Marker | PanCK/CD45 Marker (optional) | a la carte Marker (optional) | Diluted Custom Antibodies* (if applicable) | Buffer W | Total Volume |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 62.5 µL x n | 2.5 µL x n | 5 µL x n | 5 µL x n | 1.25 µL x n | up to final volume of 125 µL x n | 125 µL x n |
次に、装置のローディング中、ユーザーがinstrument Buffer 4に添加するピラノースオキシダーゼの量が減少します。このワークフローの変更は、CosMx SMI Instrument Manual (改訂前のソフトウェアv1.2用)の46ページまたはCosMx SMI Instrument Manual (ソフトウェアv1.3用)の52ページにあります。詳細については、マニュアルを参照してください。
NanoStringは、これら2つの改善点をワークフローに実装しマニュアル改訂に反映しています。
シングルセル空間データを生成する際のヒント: サンプル選択
Tip 1: 組織ブロックの品質を評価する
組織ブロックの品質は、シングルセルの空間データを生成する際の重要な変数です。高品質の組織ブロックを作成する際の 2 つの重要な要素は、固定時間と虚血時間です。
NanoString は、10% NBF または 4% PFA 固定液で固定された組織を検証しました。他の固定液の使用は一般に推奨されません。適切な固定は固定液の組織への拡散に依存するため、推奨される標本の厚さは 2 ～ 3 mm です。この厚さでは、ほとんどの組織タイプで室温で 24 時間以上の固定時間 (最大 72 時間) が必要です。より厚い組織切片や、骨、血または脂肪組織、HIV 含有組織、および特定の胎児組織などの組織タイプでは、より長い固定時間が必要になる場合があります。組織の固定が不十分だと、サンプルが劣化し、形態学的保存が不十分になる可能性があります。固定が過剰だと、非特異的なバックグラウンド染色が生じる可能性があるため、避けてください。標本の最適な固定時間は、経験的に決定する必要がある場合があります。
虚血時間とは、特定の臓器または組織が十分な血液供給を受けられず、その結果酸素と栄養素が不足する時間の長さを指します。通常、マウスの研究ではヒトの研究よりも制御が容易ですが、虚血は組織の損傷と RNA の劣化を防ぐ上で重要な要素です。虚血時間が短いほど、RNA の品質が向上します。
NanoString では、組織ブロックの品質を評価するために H&E 染色を行うことを推奨しています。H&E 染色は、組織が適切に固定されているかどうかを判断 (図 1: Leica Biosystems、Process of Fixation and the Nature of Fixatives) できるだけでなく、不均一な厚さ、裂け目、折り目、ガタつきなど、組織品質の悪い領域を記録することもできます (図 2: Leica Biosystems, H&E BasicsPart 4: Troubleshooting H&E)。この評価は、CosMx SMI 機器で実行する場合、連続切片のField of View (FOV) 配置を支援するためにも使用できます。
図 1: ブロックの品質を決定するためのH&E染色
ここで示した形態を、同じ倍率で撮影した図 3 の形態と比較してください。
図 2: 組織の取り扱いや切片の品質が悪い例
Tip 2: 組織切片の品質を評価する
組織切片の品質は、空間アッセイから生成されるシグナルに重要な役割を果たします。CosMx RNA アッセイでは、最良の結果を得るために、2 週間以内にマウントされた切片を使用することをお勧めします。切片を作成する前に、図 3 で緑色で示されているスライドのスキャン領域の中央に組織を配置するように計画します。
図 3: CosMx SMI 組織スキャンエリア
下流アッセイの成功は、切片作成とスライド準備のテクニックに依存します。切片の接着と厚さの一貫性は、下流アッセイのパフォーマンスに影響します。切片作成に関するより包括的なガイドについては、NanoString University で入手可能なSample Sectioning Tips and Tricks for CosMx SMI and GeoMx DSP Experimentsを参照してください。
組織の完全性を維持するには、平らでしっかりとマウントされた切片から始めることが重要です。図 4 は、高品質の FFPE 切片と低品質の FFPE 切片の違いを示しています。左側の切片には欠陥がほとんどなく、CosMx SMI ワークフロー中に良好なパフォーマンスを示しました。右側の切片には多くの裂け目やしわがあり、スライドからの組織剥離につながる可能性があります。この組織切片は、サンプル準備ワークフロー中にパフォーマンスが悪かったです。
図 4: 良い切片（左）と悪い切片（右）
FFPE 切片作成中に、多数の潜在的なアーティファクトが発生します。ほとんどの固形組織は、切片作成前に 30 分以上氷上に置く必要があります。ただし、脾臓や肝臓などの組織はより繊細なため、氷上に置く時間は 30 分未満に抑えることが重要です。切片は、較正済みのミクロトームで 5 μm の厚さに薄切し、スキャン領域の中央にマウントする必要があります (図 3)。ブロック面から最初の数枚の切片を必ず捨てることが重要です。包括的なガイドについては、Leica Biosystems 社の Introduction to Microtomy: Preparing & Sectioning Paraffin Embedded Tissueを参照してください。
凍結標本の場合、凍結切片は較正されたクライオスタットで 5 ～ 10 μm の厚さに薄切し、スキャン領域の中心に直接取り付ける必要があります (図 3)。切片作成中は、ハンドホイールを滑らかに、一定に回転させて組織を横切ることが重要です。ナイフエッジの温度は、切片の品質に大きな影響を与えます。ナイフエッジの温度に関する推奨事項については、表 3 を参照してください。より包括的なガイドについては、A Method for Preparation of Frozen Sections を参照してください。
Table 3: クライオスタットでの切片時のナイフエッジ温度
| Knife Temperature | Tissues |
|---|---|
| -10°C to -15°C | Adrenals, bone marrow, brain, cartilage, spleen, bloody tissue, testicular tissue |
| -15°C to -17°C | Bladder |
| -15°C to -18°C | Breast (less fatty), cervix, intestine, liver, thyroid |
| -15°C to -20°C | Kidney, lung, pancreas, prostate, ovary, rectal, skin without fat, uterus |
| -18°C to -22°C | Heart and vessel |
| -20°C to -25°C | Muscular |
| -25°C to -30°C | Skin with fat, breast (fatty) |
Tip 3: 組織のヘテロジェニティと自家蛍光を考慮する
前述のように、CosMx SMI 実験を開始する前に、連続切片で H&E 染色を行うことをお勧めします。この連続切片は、組織ブロックの品質を評価し、実験計画の重要な部分である FOV 配置のガイドとして使用できます。時間をかけて FOV 配置を適切に検討して計画することで、低品質の組織領域の選択を回避し、機器の実行時間を短縮できます。
組織の領域を選択するときは、科学的な疑問を考慮して検討してください。たとえば、以下の研究 (図 5) の焦点は、がん、筋肉、および正常組織を研究することであり、結合組織は研究対象ではありませんでした。FOV は、研究の科学的な疑問に答えるために設定されています。図 5 の左側の画像は、右側のCosMx SMI 1K RNA アッセイで実行される連続切片の FOV 配置をガイドするために使用された、 H&E 切片を示しています。また、右側の画像にはFOV あたりの RNA 数も重ねて表示されています。RNA 数は、組織の形態によって異なります。比較的低い RNA 数は、通常、結合組織、脂肪組織、粘液で観察されます。
図 5
図 6: FOV選択時に避けるべき領域
組織の自家蛍光も考慮すべき変数です。組織の自家蛍光が高いとバックグラウンドが高くなり、細胞のセグメンテーションに影響する可能性があります。実行セットアップ中に適切なプレブリーチング プロファイル (Table 4) を選択すると、自家蛍光が最小限に抑えられてデータの品質が向上します。対象の組織タイプが下表に記載されていない場合は、デフォルトの条件 (Configuration C) から開始し、必要に応じて調整します。参考までに、各構成に関連するプレブリーチング時間はTable 4 の下に記載されています。
Table 4: プレブリーチング プロファイル
| Tissue Type | RNA – Normal | RNA – Malignant | Protein |
|---|---|---|---|
| Brain | Configuration B | Configuration B | Configuration C |
| Skin | Configuration C | Configuration C | Configuration C |
| Lung | Configuration C | Configuration C | Configuration C |
| Breast | Configuration C | Configuration C | Configuration C |
| Liver | Configuration B | Configuration C | Configuration C |
| Colorectal | Configuration C | Configuration C | Configuration C |
| Tonsil | Configuration C | Configuration C | Configuration C |
| Pancreas | Configuration C | Configuration C | Configuration C |
| Kidney | Configuration B | Configuration B | Configuration C |
| Fresh Frozen | Configuration C | Configuration C | Configuration C |
| CPA | Configuration A | Configuration A | Configuration A |
プレブリーチング時間を長くする場合（例：自己蛍光が高い組織に対してConfiguration Cよりも構成 Configuration B を選択する）機器の稼働時間が長くなることに注意してください (Table 5) 。CosMx SMI 機器の操作の詳細については、 CosMx SMI Instrument User Manualを参照してください。
Table 5: プレブリーチング構成が所要時間に与える影響
| Pre-bleaching Configuration Impact on TAT/Throughput | Configuration A 30秒 | Configuration B 90秒 | Configuration C 60秒 |
| Pre-bleach duration 2 flow-cells 766 Total FOVs | 6.4時間 | 19.2時間 (12.8時間増) | 12.8時間 (6.4時間増) |
FOV を選択する際には、組織および細胞特有の蛍光を考慮することも重要です。Table 6 は、FOV の選択時に注意すべきさまざまな組織および細胞の種類の一部を示しています。
Table 6: 組織/細胞固有の自家蛍光に関する検討事項
| Tissue/Cell Type | Special Considerations |
|---|---|
| Blood Cells | 赤血球や白血球などの血液のさまざまな成分は、主にヘモグロビン含有量やその他の細胞内分子により、自家蛍光を発することがあります。 |
| Liver Tissue | 肝臓の肝細胞は、フラビンアデニンジヌクレオチド (FAD) とニコチンアミドアデニンジヌクレオチド (NADH) の含有量に起因して自家蛍光を発することがあります。 |
| Nervous Tissue | 神経系のニューロンとグリア細胞は、ミトコンドリアやその他の細胞成分のために自家蛍光を発することがあります。 |
| Lung Tissue | 肺組織は、特に肺胞内にコラーゲン、エラスチン、およびさまざまなタンパク質が存在するため、自家蛍光を発することがあります。 |
| Kidney Tissue | 腎臓内の特定の構造、例えば糸球体や尿細管などは、その構成分子により自家蛍光を発することがあります。 |
| Bone Tissue | 骨基質や骨細胞などの骨組織は、コラーゲンやカルシウムなどのミネラルが存在するため、自家蛍光を発することがあります。 |
| Pancreatic Islets | 膵臓のランゲルハンス島は、主にインスリンを含むベータ細胞の存在により、自家蛍光を呈することがあります。 |
| Intestinal Epithelium | 腸の上皮層は自家蛍光を発することがあり、これはムチンの存在と関連している可能性があります。 |
| Placenta | 多くの赤血球が含まれています – 上記の「Blood Cells」を参照してください。 |
| Lipofuscins | ニューロン、グリア細胞、心筋細胞に多く見られますが、さまざまな細胞タイプに見られ、主に有糸分裂後の細胞に見られます。リポフスチンは謎めいた化学的性質を持ち、タンパク質、炭水化物、脂質に対して陽性染色を行い、茶色に見えます。通常、360 nm から 647 nm の範囲の励起下で強い蛍光を発する小さな点状の細胞内構造として存在します。 |
| Elastin and Collagen | 通常、血管壁、弾性繊維、コラーゲンには、さまざまな励起波長にわたって強い蛍光を発する天然の蛍光分子が含まれています。 |
ご質問などがございましたら、弊社サポート NanoString Support までご連絡ください。
