CosMx™ SMIで1000プレックスのシングルセル空間解析を成功させるための3つのコツ

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本ページは2023年12月13日発行の英語版Blogを和訳しています。
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CosMx™ SMI 1000-plex RNAアッセイの結果を向上させるためのヒントや推奨事項を共有いたします。シングルセルでの空間データの品質はさまざまな要因の影響を受けるため、最良の結果を得るために、複数の組織タイプの実験条件に関する貴重な情報を提供することを目指しています。 

CosMx 1000-plex RNA アッセイ: シングルセル空間データを生成する際の考慮すべきこと

Tip 1: 組織および疾患タイプ別のデータ

組織や疾患タイプの役割を理解することは、シングルセルの空間データを解釈する上で重要です。私たちは、さまざまな組織/疾患タイプごとに、1細胞あたり検出されたトランスクリプト（カウント）の平均数（図1）と1細胞あたり検出されたユニークな遺伝子の平均数（図2）を提示します。データは、NanoString Technology Access Program（TAP）の一環として、1000-plex RNA Human Universal Cell Characterization（UCC）または1000-plex Mouse Neuroscienceパネルを利用して、210枚の外部から提供された組織スライドから収集されました。提供された組織サンプルは、TAPへの受領時にRNA品質のために事前に選別されていない実際のサンプルです。 

図1: 組織および疾患タイプ別の細胞あたりの平均転写産物数

図2: 組織および疾患タイプ別の細胞あたりの平均固有遺伝子数

まとめたこのデータから、2つの重要な観察結果が得られました。1) 転写産物/細胞および固有遺伝子/細胞で測定されるRNAシグナルは、組織タイプによって大きく異なります。この傾向は、一部は組織固有の生物学とパネルの遺伝子内容に起因しています。2) 組織タイプで観察されるシグナルのヘテロジェニティから明らかなように、組織ブロックおよび切片の品質はデータ品質に大きく影響します。CosMxワークフロー前のサンプル品質向上に向けたガイダンスを提供できるように、ナノストリングは今後も取り組んでいきます。

Tip 2: サンプル前処理条件  

CosMxのスライド準備プロトコルは、部分的に組織固有の条件で定義されます。適切なサンプル準備や実行条件を使い、さらに組織タイプによるRNAシグナルの文脈を鑑みることで、より良いシングルセルの空間データを生成して解釈することができます。詳細なガイダンスについては、CosMx Slide Preparation Manual (Appendix I and II) とSample Sectioning Tips and Tricks.  を参照してください。 

以下の表1では、さまざまな組織タイプと、データ品質を最適化するために必要な実験条件の推奨される変更点をまとめています。RNAアッセイに関しては、一部の組織タイプについて消化バッファーの濃度やターゲット回収のためのインキュベーション時間が異なる可能性があり、これは経験的に決定する必要があります。 CosMx Slide Preparation Manual のデフォルト条件から始め、必要に応じて調整することをお勧めします。 組織の剥離が観察された場合、新しい組織断片でスライド準備を開始し、ターゲット回収時間（ランタイム）を短縮してください。問題が解消しない場合は、プロテアーゼK濃度を減らすことを検討してください。   

表1: 組織タイプと生物学に基づくスライド準備の変更（参考）

以下の表2は、上記の図1と図2に示したさまざまな組織タイプについて、ターゲット回収時間、消化条件(濃度と時間)、および基準濃度を分類したものです。さらに、特定の組織に対して推奨される装置の予備漂白条件を提供します。詳細な操作手順については、CosMxSMI機器ユーザーマニュアルを参照してください。これらの条件は、経験的に決定され、ユーザー固有の調整が必要になる場合があります。

表2: 57種類の組織に対するサンプル調製条件

Tissue TypeTarget Retrieval TimeDigestion Buffer ConcentrationDigestion TimeFiducial ConcentrationPre-bleaching Profile
Appendix　虫垂15 minutes3 µg/mL30 minutes0.0005%Configuration C
Bladder Cancer　膀胱癌15 minutes3 µg/mL30 minutes0.0005%Configuration C
Bone Marrow　骨髄15 minutes3 µg/mL30 minutes0.0010%Configuration C
Bone Marrow Cancer　骨髄がん15 minutes3 µg/mL30 minutes0.0005%Configuration C
Brain　脳15 minutes3 µg/mL30 minutes0.0005%Configuration B
Brain Alzheimer’s　脳アルツハイマー病15 minutes3 µg/mL30 minutes0.0005%Configuration B
Brain Organoids　脳オルガノイド8 minutes1 µg/mL15 minutes0.0005%Configuration C
Breast　胸15 minutes3 µg/mL30 minutes0.0010%Configuration C
Breast Cancer　乳がん15 minutes3 µg/mL30 minutes0.0010%Configuration C
Cartilage　軟骨8 minutes3 µg/mL15 minutes0.0005%Configuration C
Cell Pellet Array　細胞ペレットアレイ8 minutes1 µg/mL15 minutes0.0010%Configuration A
Cholangiocarcinoma　胆管癌15 minutes3 µg/mL30 minutes0.0005%Configuration C
Chronic Kidney Disease　慢性腎臓病15 minutes3 µg/mL30 minutes0.0005%Configuration C
Colon　大腸15 minutes3 µg/mL30 minutes0.0010%Configuration C
Colitis　大腸炎15 minutes3 µg/mL30 minutes0.0005%Configuration C
Colon Cancer　大腸がん15 minutes3 µg/mL30 minutes0.0005%Configuration C
Glioblastoma　神経膠芽腫15 minutes3 µg/mL30 minutes0.0005%Configuration C
Glioma　グリオーマ15 minutes3 µg/mL30 minutes0.0005%Configuration C
Ileum　回腸15 minutes3 µg/mL30 minutes0.0005%Configuration C
Intestine　腸15 minutes3 µg/mL30 minutes0.0005%Configuration C
Kidney　腎臓15 minutes3 µg/mL30 minutes0.0010%Configuration B
Kidney Cancer　腎臓がん15 minutes3 µg/mL30 minutes0.0010%Configuration B
Kidney Metabolic Disease　腎臓代謝性疾患15 minutes3 µg/mL30 minutes0.0010%Configuration B
Liver (normal)　肝臓(正常)15 minutes3 µg/mL30 minutes0.0010%Configuration B
Liver (malignant)　肝臓(悪性)15 minutes3 µg/mL30 minutes0.0010%Configuration C
Lung　肺15 minutes3 µg/mL30 minutes0.0005%Configuration C
Lung Cancer　肺がん15 minutes3 µg/mL30 minutes0.0005%Configuration C
Lung Disease　肺疾患15 minutes3 µg/mL30 minutes0.0005%Configuration C
Lymph Node　リンパ節15 minutes3 µg/mL30 minutes0.0010%Configuration C
Lymphoma　リンパ腫15 minutes3 µg/mL30 minutes0.0005%Configuration C
Mesothelioma　中皮腫15 minutes3 µg/mL30 minutes0.0005%Configuration C
Organoid　オルガノイド8 minutes1 µg/mL30 minutes0.0005%Configuration C
Ovarian Cancer　卵巣がん15 minutes3 µg/mL30 minutes0.0010%Configuration C
Pancreas Diabetes　膵臓糖尿病15 minutes3 µg/mL30 minutes0.0010%Configuration C
Pancreatic Cancer　膵がん15 minutes3 µg/mL30 minutes0.0010%Configuration C
Pituitary Gland　下垂体15 minutes3 µg/mL30 minutes0.0010%Configuration C
Placenta　胎盤8 minutes1 µg/mL15 minutes0.0010%Configuration B
Placenta Diabetes　胎盤糖尿病15 minutes3 µg/mL30 minutes0.0005%Configuration B
Prostate Cancer　前立腺がん15 minutes3 µg/mL30 minutes0.0010%Configuration C
Rectum　直腸15 minutes3 µg/mL30 minutes0.0005%Configuration C
Retina　網膜15 minutes3 µg/mL30 minutes0.0005%Configuration C
Skin　皮膚15 minutes1 µg/mL30 minutes0.0010%Configuration C
Skin Cancer　皮膚がん15 minutes3 µg/mL30 minutes0.0005%Configuration C
Skin Lupus　皮膚狼瘡8 minutes3 µg/mL 30 minutes0.0005%Configuration C
Stomach Cancer　胃がん15 minutes3 µg/mL30 minutes0.0005%Configuration C
Tonsil　扁桃腺15 minutes3 µg/mL30 minutes0.0005%Configuration C
NHP Liver Infection　NHP肝感染症15 minutes3 µg/mL30 minutes0.0005%Configuration C
NHP Lung Granuloma　NHP肺肉芽腫15 minutes3 µg/mL30 minutes0.0005%Configuration C
NHP Lymph Node SIV　NHPリンパ節SIV15 minutes3 µg/mL30 minutes0.0005%Configuration C
Mouse Artery　マウス動脈15 minutes3 µg/mL30 minutes0.0010%Configuration C
Mouse Brain　マウス脳15 minutes3 µg/mL30 minutes0.0010%Configuration C
Mouse Brain Infection　マウス脳感染症5 minutes3 µg/mL30 minutes0.0010%Configuration C
Mouse Brain Neurodegeneration　マウス脳神経変性15 minutes3 µg/mL30 minutes0.0010%Configuration C
Mouse Colon Infection　マウス結腸感染症15 minutes3 µg/mL30 minutes0.0010%Configuration C
Mouse Lung Infection　マウス肺感染症8 minutes3 µg/mL*15 minutes0.0005%Configuration C
Mouse Retina　マウス網膜15 minutes3 µg/mL30 minutes0.0005%Configuration C
Mouse Spleen HIV　マウス脾臓HIV15 minutes3 µg/mL30 minutes0.0005%Configuration C

Tip 3: 装置のラン条件

装置の稼働時間は、調査対象の組織領域(Field of Viewの数)によって異なります。以下に示す(表3)のは、1回の実行あたりの異なる総FOV数に基づいた所要時間の推定を示します。サンプルの完全性とデータ品質は、装置の稼働時間に影響を受けます。

表3: CosMxのターンアラウンドタイム推定値

商用ソフトウェア v1.2 の場合、実行ごとの合計 FOV 数が異なります。分析時間が長くなると、RNAシグナルに影響を与える可能性があります

Analyte Plex Total Number of FOVs per Run
100 200 400 800 1200 1500
RNA 1000 3.5 4 5 7.5 11* 14* (NR)
Protein 64 1 1.5 2 3 4* 4.5*
Total Tissue Area (mm2) 26 52 104 209 313 392
全ての時間は日単位です。 *現在の1つのフローセルにおけるFOV（Field of View）の最大数は999です（商用ソフトウェア v1.2）。この数は、次のソフトウェアリリースで1149 FOVに増加します。
NR:お勧めしません

ユーザー様におかれましては、提供された「ターンアラウンドタイム　ガイダンス」内にとどまることをお勧めします。 

CosMxをお選びいただきありがとうございます。ご不明な点やサポートが必要な場合は、サポートチーム(Support@nanostring.com)までお気軽にお問い合わせください。

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By Vik Devgan
For research use only. Not for use in diagnostic procedures.

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